前言
本標準代替GB/T 4789.5-2003《食品衛生微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗》。
本標準與 GB/T 4789.5-2003 相比，主要變化如下：
——修改了標準名稱；
——修改了培養基和試劑；
——修改了操作步驟中增菌部分和生化試驗及附加生化試驗部分；
——修改了表2
——修改了表4
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗
1 范圍
本標準規定了食品中志賀氏菌(Shigella)的檢驗方法。
本標準適用于食品中志賀氏菌的檢驗。。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
a） 恒溫培養箱：36 ℃ 1 ℃；
b） 冰箱：2 ℃～5 ℃；
c） 膜過濾系統；
d） 厭氧培養裝置：41.5 ℃?1 ℃；
e） 電子天平：感量 0.1 g；
f） 顯微鏡：10 ～100 ；
g） 均質器；
h） 振蕩器；
i） 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；
j） 無菌均質杯或無菌均質袋：容量 500 mL；
k） 無菌培養皿：直徑 90 mm；
l） pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
m） 全自動微生物生化鑒定系統。
3? 培養基和試劑
3.1 志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素：見附錄 A 中 A.1。
3.2? 麥康凱（MAC）瓊脂：見附錄 A中 A.2。
3.3? 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂：見附錄 A 中 A.3。
3.4? 志賀氏菌顯色培養基。
3.5 三糖鐵（TSI）瓊脂：見附錄 A中 A.4。
3.6? 營養瓊脂斜面：見附錄 A? 中 A.5。
3.7 半固體瓊脂：見附錄 A 中 A.6。
3.8 葡萄糖銨培養基：見附錄 A中 A.7。
3.9? 尿素瓊脂：見附錄 A中 A.8。
3.10? β-半乳糖苷酶培養基：見附錄 A中 A.9。
3.11 氨基酸脫羧酶試驗培養基：見附錄 A中 A.10。
3.12 糖發酵管：見附錄 A 中 A.11。
3.13 西蒙氏檸檬酸鹽培養基：見附錄 A中 A.12。
3.14 粘液酸鹽培養基：見附錄 A 中 A. 13。
3.15 蛋白胨水、靛基質試劑：見附錄 A中 A.14。
3.16 志賀氏菌屬診斷血清。
3.17 生化鑒定試劑盒。
4 檢驗程序
志賀氏菌檢驗程序見圖 1。
5? 操作步驟
5.1 增菌
以無菌操作取檢樣 25 g（mL），加入裝有滅菌 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質杯，用旋轉刀片式均
質器以 8 000 r/min～10 000 r/min 均質；或加入裝有 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質袋中，用拍擊式均質
器連續均質 1 min～2 min，液體樣品振蕩混勻即可。于 41.5 ℃±１℃，厭氧培養 16 h～20 h。
5.2 分離
取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于 XLD 瓊脂平板和 MAC 瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養基平板
上，于 36 ℃±1 ℃培養 20 h～24 h，觀察各個平板上生長的菌落形態。宋內氏志賀氏菌的單個菌落直徑大
于其他志賀氏菌。若出現的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續培養至 48 h 再進行觀察。志賀氏菌在
不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見表 1。
5.3 初步生化試驗
5.3.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，分別接種TSI、半固體和營養瓊脂斜面各一
管，置36 ℃±1 ℃培養20 h～24 h，分別觀察結果。
5.3.2 凡是三糖鐵瓊脂中斜面產堿、底層產酸（發酵葡萄糖，不發酵乳糖，蔗糖）、不產氣（福氏志賀氏
菌6型可產生少量氣體）、不產硫化氫、半固體管中無動力的菌株，挑取其5.3.1中已培養的營養瓊脂斜面
上生長的菌苔，進行生化試驗和血清學分型。
5.4 生化試驗及附加生化試驗
5.4.1 生化試驗
用 5.3.1 中已培養的營養瓊脂斜面上生長的菌苔，進行生化試驗，即 β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫
羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗。除宋內氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌 13 型的鳥氨酸
陽性;宋內氏菌和痢疾志賀氏菌 1 型，鮑氏志賀氏菌 13 型的 β-半乳糖苷酶為陽性以外，其余生化試驗志賀
氏菌屬的培養物均為陰性結果。另外由于福氏志賀氏菌 6 型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相
似，必要時還需加做靛基質、甘露醇、棉子糖、甘油試驗，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧
化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集，仍不得
判定為志賀氏菌屬。志賀氏菌屬生化特性見表 2。
5.4.2 附加生化實驗
由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型）
菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集；因此前面生化實驗符合志賀
氏菌屬生化特性的培養物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36 ℃培養 24 h～48 h)。志
賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D 菌的生化特性區別見表 3。
5.4.3 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統，可根據5.3.2的初步判斷結果，用5.3.1中已培
養的營養瓊脂斜面上生長的菌苔，使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統進行鑒定。
5.5 血清學鑒定
5.5.1抗原的準備
志賀氏菌屬沒有動力，所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體（O）抗原。菌體 O 抗原又可分為
型和群的特異性抗原。
一般采用 1.2%～1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。
注 1：一些志賀氏菌如果因為 K 抗原的存在而不出現凝集反應時，可挑取菌苔于 1 mL 生理鹽水做成濃菌液，100 ℃煮
沸 15 min～60 min 去除 K 抗原后再檢查。
注 2：D 群志賀氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，與其他志賀氏菌群抗原不存在交叉反應。與腸桿菌科不
同，宋內氏志賀氏菌粗糙型菌株不一定會自凝。宋內氏志賀氏菌沒有 K 抗原。
5.5.2 凝集反應
在玻片上劃出 2 個約 1cm×2cm 的區域，挑取一環待測菌，各放 1/2 環于玻片上的每一區域上部，在其
中一個區域下部加 1 滴抗血清，在另一區域下部加入 1 滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環或針分
別將兩個區域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合 1 min，并對著黑色背景進行觀察，如果抗血清
中出現凝結成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒有發生自凝現象，那么凝集反應為陽性。如果生理鹽水中出現
凝集，視作為自凝。這時，應挑取同一培養基上的其他菌落繼續進行試驗。
如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征，而其血清學試驗為陰性的話，則按 5.5.1 注 1 進行
試驗。
5.5.3 血清學分型（選做項目）
先用四種志賀氏菌多價血清檢查，如果呈現凝集，則再用相應各群多價血清分別試驗。先用 B 群福氏
志賀氏菌多價血清進行實驗，如呈現凝集，再用其群和型因子血清分別檢查。如果 B 群多價血清不凝集，
則用 D 群宋內氏志賀氏菌血清進行實驗，如呈現凝集，則用其Ⅰ相和Ⅱ相血清檢查；如果 B、D 群多價血
清都不凝集，則用 A 群痢疾志賀氏菌多價血清及 1～12 各型因子血清檢查，如果上述三種多價血清都不凝
集，可用 C 群鮑氏志賀氏菌多價檢查，并進一步用 1～18 各型因子血清檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的
型抗原和群抗原鑒別見表 4。
5.6 結果報告
綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果，報告 25 g（mL）樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。
|
